普渡大学廖攀：解析抗癌化合物生物合成途径，合成生物学或助力更多像青蒿素一样的化合物实现产业化丨专访

疟疾，是全球关注的重要公共卫生问题之一，中国科学家屠呦呦因发现并从黄花蒿中提取了青蒿素，获得 2011 年拉斯克临床医学奖和 2015 年诺贝尔医学奖。青蒿素的发现，使数百万人免死于疟疾。类似于青蒿素，很多广泛存在于植物中的天然产物，具有重要的生理活性，是开发新药和研究天然产物的重要来源。

近日，美国普渡大学农学院生物化学系杰出教授及普渡植物生物学中心主任 Natalia Dudareva 领导的研究小组绘制了中药材百里香和牛至中抗癌化合物的生物合成途径，相关论文以题为 “The biosynthesis of thymol, carvacrol, and thymohydroquinone in Lamiaceae proceeds via cytochrome P450s and a short-chain dehydrogenase” 发表于 Proceedings of the National Academy of Sciences 期刊。

本论文共同第一作者廖攀博士告诉生辉 SynBio：“该研究不仅为更好地理解有效活性成分的生物合成、转运和释放提供了坚实的理论基础，还为今后利用植物生物技术、代谢工程和合成生物学技术在植物或其他微生物中生产高附加值、具有药用价值或营养价值的活性成分提供了新的策略和工具。”

廖攀就读于香港大学分子生物学专业，期间主要从事植物异戊二烯萜类生物合成早期途径重要酶基因的功能、活性萜类化合物的生物技术相关研究；2015 年博士毕业之后，他继续在香港大学从事博士后研究工作，主要研究甲羟戊酸途径与其他生物代谢途径的关联和相互影响；2018 年，廖攀如愿申请进入 Natalia Dudareva 教授实验室从事研究工作，研究领域包括药用植物中活性成分的生物合成途径解析和矮牵牛花中挥发性有机化合物的转运和释放机理研究。

图 | 廖攀（来源：受访人提供）

抗癌化合物迈出药物生产第一步

百里酚 (thymol)、香芹酚 (carvacrol) 和百里氢醌 (thymohydroquinone) 是中药材百里香、牛至和其他唇形科植物中含有的单萜酚类化合物，虽然已有很多关于它们具有抗癌特性的报道，但目前百里酚仅应用于精油、漱口水等商业化产品，百里香氢醌相关的商业化产品在市场上暂时还未出现。

究其原因，主要是植物生长周期长，而且植物体内该化合物的含量较低（百里氢醌的含量尤其低），提取和分离工艺要求较高，难以大量获得。这也意味着，明确抗癌化合物的合成路径，利用微生物异源合成提升其合成规模，是迈向药物生产的第一步。

迄今为止，只有少数具有药用价值的氧化萜烯的生物合成途径被完全阐明，如青蒿素、紫杉醇以及鼠尾草和迷迭香等倍半萜或二萜酚类化合物。对于单萜类化合物，只有薄荷醇及其衍生物在薄荷中描述了一个复杂的生物合成途径。然而，像百里酚或香芹酚这样的单萜酚类化合物的生物合成途径仍未被解析。

廖攀所在的团队通过与德国马丁路德 - 哈勒维腾贝格大学（Martin Luther University Halle-Wittenberg）和密歇根州立大学（Michigan State University）的科学家合作，发现了百里氢醌的整个生物合成途径，包括其前体百里酚和香芹酚以及在这个过程中不稳定的中间化合物的形成。

在本项研究中，德国团队主要集中在百里酚和香芹酚的生物合成途径解析，廖攀所在团队的研究则主要集中在百里氢醌的合成途径解析。

根据廖攀的介绍，研究中首先要确定形成百里氢醌所需的基因。“我们通过代谢成分分析和高通量转录组学以及相关性分析，从植物组织样本中筛选了 70,000 多个基因，再从中筛选出最有可能的 7 个候选基因在本氏烟草中进行功能验证，最后将范围缩小至两个基因。”

而确定形成百里氢醌所需基因的最终验证步骤是在酵母细胞中完成的。具体来说，廖攀团队根据预测的底物和产物的化学结构，推测这一步反应应该是由 P450 单加氧酶催化的羟基化反应。P450 单加氧酶基因一般都是膜蛋白基因，原核生物如大肠杆菌没有核膜，而研究的植物包括百里香和牛至还没有稳定的遗传转化体系，也就是说，不能通过在大肠杆菌或者百里香和牛至中过量表达候选基因验证基因功能。基于以上条件，酵母细胞更适合 P450 单加氧酶膜蛋白正常执行其功能。

早在 2016 年，廖攀及团队就曾在 Biotechnology Advances 上发表综述指出，以酵母为底盘具有以下优势：

第一，酵母和植物一样都是真核生物，有核膜；第二，相比于植物，酵母生长更快，在生成目标产物的效率上会更有优势；第三，酵母遗传转化体系成熟；第四，酵母本身存在甲羟戊酸途径，这是合成上万种异戊二烯萜类化合物的通用前体的两条途径中的其中一条，而原核生物如大肠杆菌中本身是不存在甲羟戊酸途径的，因此酵母相比大肠杆菌可以更好地耐受甲羟戊酸途径来源的中间产物（甲羟戊酸、异戊二烯焦磷酸）的毒性。比如，酵母相比大肠杆菌能更耐受异戊二烯萜类化合物 - 金合欢烯。

事实上，1978 年时，曾有华盛顿州立大学的学者在 Archives of Biochemistry and Biophysics 期刊上发表论文，推测百里香酚是由 γ- 萜品烯芳构化为对伞花烃，然后对伞花烃经过羟基化反应而形成。

而廖攀则表示，“我们发现百里酚和香芹酚的芳香骨架是由 γ- 萜品烯通过 P450 单加氧酶与脱氢酶通过两个不稳定的中间体形成的，而不是通过以前认为的中间体对伞花烃形成的。”

对于该研究，廖攀也指出了其中存在的一些挑战。“P450 单加氧酶的位置特异性还需继续研究，每个 P450 单加氧酶基因编码的蛋白氨基酸中哪些氨基酸是关键活性位点，以及我们是否可以在继续了解以上两个问题的基础上，通过结合蛋白三级结构预测、AI 设计、酶的定向进化、提高酶的催化效率和提高目标产物的产率。另外，我们在这项研究中所报道的这些基因是否可以用于生物合成其他结构类似的化合物还不清楚，这些都需要进一步的研究。”

总体来说，该研究不仅解析了百里氢醌的整个生物合成途径，还发现百里酚和香芹酚的生成机理与之前领域内科学家普遍认为的不一样。

图丨该文献推测百里香酚是由 γ- 萜品烯芳构化为对伞花烃，然后对伞花烃经过羟基化反应而形成。（来源：论文）

“会有更多像青蒿素一样的化合物实现产业化”

合成生物学从概念的提出到具体应用不过短短十余年的时间，合成生物学理论和技术的迅猛发展对生命科学基础研究和工业生物技术产生了深远影响，其通过生物合成各种高附加值产品的绿色生产方式展现出了巨大的应用前景和赋能潜力。

廖攀表示本研究也具有一定的商业转化潜力。“我们的研究为在植物或微生物如酵母中生产具有药用价值的百里氢醌开辟了一条新的道路，其应用场景包括用于生产含有百里酚、香芹酚和百里香氢醌的食品（香料、调味料）、精油和药品等。”

“但这项研究主要是实现了从‘0’到‘1’的突破。百里酚、香芹酚和百里氢醌在酵母和本氏烟草中的生成效率还有待提高，整个途径和生产工艺还需要继续优化以达到商业化水平，也就是从 ‘1’ 到 ‘100’ 或 ‘1000’ 所需要做的事情。”

“我个人非常看好和相信合成生物学在植物领域应用前景。并且，目前也已经出现了众多成功案例。”

一个具有代表性的例子是青蒿素。青蒿素来源于黄花蒿，青蒿素及其衍生物是有效的抗恶性疟原虫疟疾药。中国科学家屠呦呦因发现从黄花蒿提取青蒿素的方法获得 2015 年诺贝尔医学奖。合成生物学在青蒿素的合成方面也取得了巨大进展。

美国加州伯克利大学的 Jay D. Keasling 教授带领的团队采用合成生物学技术已经实现了工程酵母中青蒿素的商业化生产。最新进展还包括 Jay D. Keasling 带领的团队在酿酒酵母中利用合成生物学技术成功合成了天然和非天然的大麻素类化合物 (Luo et al., 2019, Nature)。值得注意的是，该论文第一作者罗小舟已于 2019 年回国，现在是中科院深圳先进技术研究院合成生物化学研究中心执行主任及研究员，罗小舟带领的团队在继续从事合成生物学相关的研究及其产业化，并已孵化了森瑞斯生物科技有限公司。

图丨 Jay D. Keasling 教授团队在酿酒酵母中利用合成生物学技术成功合成了天然和非天然的大麻素类化合物。（来源：论文）

托烷生物碱也能够通过工程酵母进行生产。来自茄属植物的托烷生物碱是神经递质抑制剂，用于治疗神经肌肉疾病并被世界卫生组织归类为必需药物。斯坦福大学的 Christina D. Smolke 教授团队在酵母中通过合成生物学技术过量表达来自酵母、细菌、植物和动物的超过 20 个基因，成功合成了药用拓品烷生物碱如莨菪碱和东莨菪碱 (Srinivasan and Smolke, 2020, Nature)。

图丨 Christina D. Smolke 教授团队在酵母中成功合成了药用拓品烷生物碱如莨菪碱和东莨菪碱。（来源：论文）

另外，秋水仙碱在很多个国家和地区都被用于治疗痛风急性发作，还可以用于治疗炎症性疾病。斯坦福大学的 Elizabeth S. Sattely 教授团队成功采用合成生物学技术将来自嘉兰的 16 个不同的基因，包括她们从嘉兰中发现的生物合成秋水仙碱的前体 N- 甲酰秋水仙胺的 8 个新的基因，在本氏烟草中瞬时表达生成了秋水仙碱的前体 N- 甲酰秋水仙胺。

图丨 Elizabeth S. Sattely 教授团队成功在本氏烟草中合成秋水仙碱的前体 N - 甲酰秋水仙胺

在采访最后，廖攀用充满希望的语气表示，“未来，一定会有更多的植物来源的具有药用价值、营养价值和经济价值的化合物或已经商业化的药品中的主要化学成分的生物合成途径被解析，并在植物、微生物或细菌中被合成。可以预见，不久的将来，会有更多的像青蒿素一样的化合物通过合成生物学技术实现产业化。”

参考资料：

• https://www.purdue.edu/newsroom/releases/2021/Q4/plant-scientists-find-recipe-for-anti-cancer-compound-in-herbs.html

• https://www.pnas.org/content/118/52/e2110092118.short

• https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003986178900395?via%3Dihub

• https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30814733/

• https://www.nature.com/articles/s41586-020-2650-9

• https://www.nature.com/articles/s41586-020-2546-8

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